на электронную версию
журнала и новости
В течение последнего времени в России уделяется существенное внимание вопросам в области воспроизводства стада и повышения уровня племенных качеств животных, так как это является краеугольным камнем в отечественном животноводстве. Однако успешное решение данных вопросов невозможно без использования современных методов и технологий, которые уже давно нашли свое применение в развитых странах Запада.
Получение эмбрионов крупного рогатого скота методом in vitro современный и прогрессивный биотехнологический метод, позволяющий значительно ускорить процесс воспроизводства высокопродуктивных животных. Данный метод состоит из нескольких этапов: извлечение ооцитов из антральных фолликулов яичника (OPU-Ovum Pick-Up), созревания ооцитов (IVM–in vitro maturation); оплодотворения (IVF–in vitro fertilization) и эмбриональной культуры (IVC – in vitro culture). Важным аспектом данной технологии является то, что получать яйцеклетки от животных доноров можно как прижизненно, используя метод транс вагинальной аспирации, так и от убойного материала (яичники коров с мясокомбината). Оплодотворение яйцеклеток является наиболее важным этапом, определяющим успех и результативность получения эмбрионов методом in vitro. Традиционно при производстве эмбрионов методом in vitro в технологии оплодотворения используется криоконсервированное семя быков производителей. При этом в случае эмбриопересадки и наступлении стельности пол будущего телёнка неизвестен, это может быть либо бычок либо тёлочка. В молочном скотоводстве получение тёлочек с высокой продуктивностью наиболее важно.
Получение разделённых по полу эмбрионов это перспек- тивный метод, позволяющий получать особей жательного пола, в зависимости от производственной специфики хозяйства. Для полчения разделён ных по полу эмбрионов КРС в технологии оплодотворения используется сексированное семя быков. Однако данный метод недостаточно распространён. Ввиду ряда причин:
• низкая концентрация сперматозоидов в спермодозе, порядка 3,5 млн;
• низкий выход полноценных для оплодотворения спермиев при использовании метода (swim-up);
• высокая стоимость одной спермодозы.
В связи с этим перед нами стояла задача разработки наиболее оптимального протоколла оплодотворения яйцеклеток сексированной спермой, а также подбор культуральной системы позволяющей получать наилучшие условия для развития доимплотированных эмбрионов. Отработка данной технологии осуществлялась на базе производственной лаборатории «Центра по трансплантации эмбрионов КРС» ООО «Бетагран- Липецк».
Для этого ооциткумулюсные комплексы получали прижизненно из антарльных фолликулов диаметром 2-6 мм от коров доноров методом TAU (транс вагинальной аспирации). После чего ооциткумулюсные комплексы помещались в среду дюльбекко с добавлением с 5% эстральной сыворотки, 4% р-ра гентамицина и р-ра гепарина. Поиск и морфологическую оценку осуществляли на стереомикроскопе лабораторного класса Olympus SZ51 при 200 кратном увеличении. Для экспериментов отбирали ооциты средней величины с мелкозернистой ооплазмой, окруженные компактным многослойным кумулюсом. Для дозревания ооцитов использовали среду 199 (Medium 199, Hepes modification, 25 mM) с добавлением 10% эстральной сыворотки крови крупного рогатого скота, Na-пирувата, BSA, 1.0 ЕД/мл лютенизирующего гормона, 10 ME/мл, фолликулостимулирующего гормона, 1,0 мкг/мл эстрадиола (спиртовой раствор) и 50 мкг/ мл гентамицина.
Ооциты помещали в лунки планшетов в среду созревания объёмом 500 мкл под минеральным маслом (“Sigma”, США) и культивировали в течение 20-24 часов при температуре 38,5-39 в атмосфере 5% CO2 в воздухе. Для оплодотворения использовали разделённое по полу криоконсервированное семя быков в пайетах объёмом 0,25 мл из расчёта 1 доза на 30 яйцеклеток. Оттаивание производили при температуре +37ºС в течение 40 секунд. По той же схеме оттаивалось и обычное семя быков. Получение подвижной фракции сперматозоидов проводили путём центрифугирования в градиенте плотности (р-р перколла) при оборотах ротора центрифуги 300G. В результате проведённых нами опытов было установленно, что выход подвижных сперматозоидов при центрифугировании в градиенте плотности был больше, чем при использовании метода флотации (Swim Up). Для оплодотворения яйцеклетки перемещались в лунки со средой Fert-TALP объёмом 80 мкл и инкубировались совместно со сперматозоидами в течение 18-20 часов при температуре 38,5-39 в атмосфере с содер- жанием 5% CO2 .
После оплодотворения зиготы отмывали в растворе SOF и механически удаляли клетки кумулюса посредством пипетирования при помощи наконечников для денудации ооцитов диаметром 135 мкм. Очищенные зиготы помещались в среду на основе SOF c добавлением BSA, MEM vitamins, MEM Niaa, MEM iaa в лунки планшетов объёмом 500 мкл, покрытые минеральным маслом (Sigma ,США) и культивировались при температуре 38,5ºС в увлажненной атмосфере под газовой фазой (по 5% CO2 и O2 и 90% N2 ) в течение 7-8 суток. Количество оплодотворённых зигот подсчитывали через 48 и 62 часа после оплодотворения.
Для опыта по определению эффективности оплодотворения сексированной спермы использовалось заморожено-оттаянное семя пяти быков. Было оплодотворено 1050 яйцеклеток. Из них у 944 началось дробление, средний процент дробящихся яйцеклеток составил 89,93%. Выход доимплонтированных бластоцист от числа поставленных на созревание яйцеклеток составил 29,42%.
Во втором случае использовалось обычное заморожено-оттаянное семя от четырёх быков. Было оплодотворено 770 яйцеклеток, полученных методом OPU. Из них у 708 началось дробление, средний процент дробящихся яйцеклеток составил 91,94%. Выход доимплонтированных бластоцист от числа поставленных на созревание яйцеклеток составил 35,58%.
Таким образом, сравнивая вышеперечисленные данные можно сделать вывод, что оплодотворяющая способность сексированного и традиционного семени не имеет значительных расхождений.
Так разница составила 2,01% в пользу обычного семени. Выход эмбрионов был больше на 6,16 в пользу обычного семени. Несмотря на то, что культивирование эмбрионов производилось на одной культуральной системе количество полученных эмбрионов in vitro было выше в группе, где использовалось обычное семя. Мы предполагаем, что это связанно с окрашиванием сперматозоидов флуоресцентной краской из за чего снижается энергетический запас, что и может обуславливать меньший жизненный потенциал гамет по сравнению с обычным семенем, как следствие остановку развития некоторых эмбрионов.
Тем не менее, несмотря на чуть менее высокие результаты по выходу сексированных эмбрионов, от одной дозы семени в среднем было получено 8 эмбрионов, а частота рождения тёлочек при пересадке эмбриона составила 93%.
Таким образом, наши данные свидетельствуют о том, что разработанный протокол оплодотворения и культуральная система обладают высоким потенциалом и позволяют получать в массовом количестве разделённые по полу эмбрионы по технологии in vitro, а так же могут использоваться для получения, зигот и предымплантационных эмбрионов КРС in vitro для различных биотехнологических программ.
Доктор сельскохозяйственных наук Голубец Л.В.;
Кандидат сельскохозяйственных наук Дешко А.С.;
Главный биотехнолог Хромов Н.И.;
Старший эмбриолог Машталер Д.В.
Смотрите также
