«Сравнительная эффективность витрификации и программной крио консервации эмбрионов КРС полученных методом in vitro»

Известно, что биологические материалы такие как интактные эмбрионы, при обычных условиях подвержены изменениям и разрушению. Использование низких температур для длительного хранения зародышей повсеместно востребованный биотехнологический метод. Доказано, что при достижении критической температуры, известной также как температура «стеклования» составляющая -130°C образец может храниться неопределенно долгое время при практически полном отсутствии биохимических процессов.

Сохранение зародышей столь долгое время открывает для исследователей широкий спектр возможностей и позволяет создавать обширные хранилища «эмбриобанки» где могут храниться десятки тысяч эмбрионов редких и исчезающий пород, так и видов животных. Что позволяет проводить как фундаментальные исследования, а также сохранять и восстановить генетическое разнообразие.

Развитие зародыша в искусственной среде имитирующей жидкости яйцевода к сожалению, не в полной мере обеспечивает потребности зародыша в макро и микроэлементах, витаминах и аминокислотах. Известно, что эмбрионы, полученные методом in vitro обладают более низким функциональным статусом. Клеточная масса эмбриобласта и трофобласта ниже чем у эмбрионов, полученных классическим методом in vivo. В следствии чего эмбрионы более восприимчивы к крио повреждениям и требуют применения более деликатных методов криоконсервации позволяющих гарантированно сохранить качество эмбриона.

В связи с чем для определения оптимального протокола и метода заморозки нами были проведены ряд опытов по сравнению методов крио консервации, а также растворов криопротекторов.

 Для опыта использовали доимплонтированные эмбрионы КРС полученные из ооциткумулюсных комплексов. Ооциткумулюсные комплексы извлекали прижизненно методом TAU (транс вагинальной аспирации) из антральных фолликулов яичников коров доноров. Поиск и морфологическую оценку осуществляли на стереомикроскопе лабораторного класса, Olympus SZ51 при 16 кратном увеличении. Для дозревания  ооцитов  использовали  среду  199  (Medium 199, Hepes modification, 25mM.) с добавлением 10%  эстральной сыворотки крови крупного рогатого скота, Na-пирувата,  BSA, 1.0 ЕД  /  мл  лютенизирующего гормона, 10 ME/мл, фолликулостимулирующего гормона,  1,0мкг  /  мл  эстрадиола (спиртовой раствор) и  50 мкг / мл гентамицина.

Для оплодотворения использовали среду Fert-TALP и  разделённое по полу  криоконсервированное семя быков. Для оплодотворения яйцеклетки перемещались в лунки со средой объёмом 80 мкл.  И инкубировались совместно со сперматозоидами в течении 18-20 часов при  температуре  38,5-39  в  атмосфере с содержанием 5  %  CO2. После оплодотворения зиготы отмывали в растворе SOF и механически удаляли клетки кумулюса посредством пепетирования при помощи наконечников для денудации ооцитов диаметром 135 мкм. Очищенные зиготы помещались в среду на основе SOF  c добавлением BSA, MEM vitamins,   MEM Niaa, MEM iaa в лунки планшетов объёмом 500 мкл, покрытые минеральным маслом  (  Sigma ,США)  и культивировали при температуре 38,5º С  в увлажненной  атмосфере  под газовой  фазой (по  5% CO2  и  O  2  и  90 % N2) в течение 7-8 суток. Для опыта использовали эмбрионы только отличного качества находящихся на стадии развития от BL-II ( поздняя бластоциста) до BL-IV (полностью Экспандированная Выход доимплонтированных бластоцист от числа поставленных на созревание яйцеклеток составил 29,42%

Криоконсервация опытных образцов осуществлялась на штатном замораживателе фирмы «CRYOLOGIC» модель CL 5500

Рис 1

И при помощи готовых наборов криопротекторов для витрификации фирмы «Криотек». Насыщение эмбрионов криозащитными растворами проводили по следующей ссхеме.

Таблица 1

№ п/п

Наименование крипротектора

Кол-во ступений насыщения

Время насыщения

Мин.

Носитель

№ программы

 

Способ криоконсервации

1

EG-1,5 М

1

10

Пайета 0,25 мл

1

CL5500

2

EG-1,8 М

1

10

Пайета 0,25 мл

1

CL5500

3

GL-1,4 М

2

15

Пайета 0,25 мл

1

CL5500

4

EG-DMSO

2

13

криотоп

-

витрификация


Для криоконсервации эмбрионов 1, 2 и 3 группы использовали программу где начало охлаждения идёт с + 20˚С, охлаждение ведётся со скоростью 2˚С/мин. до -6 ˚С далее индукция кристаллизации и выдержка при этой температуре в течении 10 мин, далее охлаждение до -35˚С со скоростью 0,5˚С/мин. После завершения цикла заморозки пайеты с эмбрионами переносились в жидкий азот и хранились при температуре -196ºС.

Четвёртая группа замораживалась витрификацией где в качестве криопротектора использовали стандартный раствор фирмы «Криотек»

Насыщение эмбрионов криопротектором осуществляли по схеме, приведённой на Рис. 2

Рис 2. Схема насыщения эмбриона криопротектором для витрификации

После проводки в растворе криопротектра эмбрион помещался на носитель «криотоп» и погружался в жидкий азот (N2).

Оттаивание пайет с эмбрионами 1,2 и 3 групп производилось в водяной бане при температуре +37ºС. Эмбрионы криоконсервированные методом витрификации оттаивались по схеме, представленной на рис. 2

Рис.3 Девитрификация эмбрионов

Морфологическая оценка производилась на стереомикроскопе Olympus SZ 51 при 40 кратном увеличении. Эмбрионы оценённые как пригодные после выведения криопротектора помещались с среду SOF.

Таблица 2 Результаты испытаний

№ п/п

Кол-во бластоцист

Метод криоконсервации

Наименование криопротектороа

Кол-во пригодных после оттаивания n-%

1

96

програмная

EG-1,5 М

67

69,50%

2

84

програмная

EG-1,8 М

50

59,44%

3

93

програмная

GL-1,4 М

68

71,03%

4

77

витрификация

EG+DMSO

75

97,40%

Исходя из данных Таблицы 2 можно сделать вывод, что наилучший результат сохранности показали эмбрионы 4 группы крио консервированные витрификацией из 77 замороженных эмбрионов 75 получили оценку как пригодные, что составило 97,40%. Наименьший результат сохранности показали эмбрионы крио консервированные в 1,8 М этиленгликоле, что составило 50 пригодных эмбрионов или 59,44%. Эмбрионы замороженные в 1,5 М этмленгликоле и 1,4 М глицерин заняли промежуточное положение.

Выводы:

Основываясь на результатах проведённых исследований можно сделать вывод, что метод витрификации позволяет достигать минимальных потерь при заморозке эмбрионов и составил 2,6 %. На данный момент ведутся работы по разработке системы витрификации на прямую пересадку.

Смотрите также
Партнеры
Мы в соцсетях :
apknews.su © 2019
г. Ростов-на-Дону
Бульвар Комарова, 28Г